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DNA电泳常见问题

关注:177 发表时间:2020-02-27 00:00:00

DNA电泳常见问题

1. TAE与TBE各自分离范围

       TAE缓冲液推荐用于分析分子量大于1500 bp DNA片段和超螺旋DNA条带;TBE缓冲液推荐用于分析分子量小于1500 bp DNA片段和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。大片段DNA分子在TBE缓冲液中不能完全分离。 

2. 电泳凝胶

正确的凝胶浓度对DNA Marker的优化分离非常重要。DNA Marker中分子量偏小的较精确分离型DNA Marker(例如DL1003等)一般选择高浓度凝胶,比如琼脂糖凝胶浓度选择在1.5%-3%之间;而较大分子量的DNA Marker(例如DL10004等),琼脂糖凝胶浓度一般选择在0.7%-1.5%。

制备凝胶的缓冲液要和电泳缓冲液保持一致,此外一定要在凝胶完全凝固后再拔去梳子。

3. 电泳条件

       电泳时,电压建议为5-8 V/cm。电压过低会导致条带弥散。电压过高会使凝胶过热和DNA变性,还可能出现条带弯曲等带型。条带较多的DNA Marker如DL0502,DL10004等一般选择低电压,建议为5-6 V/cm。  

      电泳缓冲液不宜太陈旧,应该定期更换;电泳时,凝胶尽量放电泳槽中间,在电泳槽两边可能导致条带倾斜。

4. DNA Marker放置条件

DNA Marker较频繁使用的可以室温或4℃放置,否则可以-20℃保存。

5. DNA条带出现弥散,弯曲等不规则带型 

DNA Marker条带出现弥散或者涂抹,可能原因有DNA降解,电泳时间过长、电压过低、过量染色和脱色、紫外拍照时间过长。

DNA 条带出现弯曲、月牙形状以及锯齿状等不规则带型,可能为电压过高,上样量太多、凝胶没有溶解好、凝胶没有完全凝固、胶孔质量差、成分中含有杂质如蛋白质、样品中盐浓度与缓冲液盐浓度存在较大差异等等。

6. 电泳时Marker前端条带容易变弱或是丢失 

常用染料如溴化乙啶(EB)等带正电荷,而核酸带负电荷,电泳过程中溴化乙啶(EB)迁移方向与核酸相反并且两者结合不是十分牢固,导致凝胶前端结合核酸的溴化乙啶(EB)脱落并向凝胶后端迁移,从而前端条带显得较弱或是丢失。一般电泳时溴酚蓝迁移到凝胶长度2/3及可停止。

7. 凝胶浓度影响电泳分离效果

条带多数由小于1500 bp DNA片段组成的DNA Marker一般选择高浓度凝胶,琼脂糖凝胶浓度建议在1.5%-3%,而条带多数由大于1500 bp DNA片段组成的DNA Marker一般选择低浓度凝胶,琼脂糖凝胶浓度建议在0.7%-1.5%。


                                                                     

                                               图1                                图2           

      在以上两幅图中,图1和图2为同样的一种DNA Marker(条带多数由小于1500 bp DNA片段组成)在相同电泳条件和电泳时间,不同凝胶浓度的电泳结果。

1琼脂糖凝胶浓度为0.8%

        图2琼脂糖凝胶浓度为2%。结果显示出在浓度为0.8%的凝胶中很难达到较好的分离效果。

8. 电泳出现样品滞留在点样孔

    DNA结合蛋白(如连接酶、磷酸酶、限制酶等)改变DNA的凝胶迁移率,可能导致DNA停留在点样孔处;上样量过多、DNA降解或是胶孔质量较差等也都有可能出现滞留在点样孔现象。

 

如上图:M: DNA Marker DL2503  1和2泳道出现滞留胶孔现象

9. 样品条带与DNA Marker条带相比,出现比实际大小偏大现象

DNA的迁移不仅仅与其实际大小有关系,与是否结合有蛋白、离子状态、DNA的结构、凝胶结构等都有关。在电泳时,单个样品条带的大小与DNA Marker相比,会出现偏大几十bp之多。

10. 盐浓度对电泳影响

电泳时的盐浓度影响DNA的带型。配胶的缓冲液和电泳缓冲液最好为同时配置,电泳槽中缓冲液要及时更换,样品及Marker中的上样Buffer要尽量保持一致。电泳出现不规则条带,可能需要考虑盐浓度问题。如果是样品中盐分过多,有必要进一步的纯化。


 

  

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