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DNA凝胶回收常见问题及对策

浏览:14 发表时间:2020-02-26 00:00:00

DNA凝胶回收常见问题及对策

1. 没有回收到DNA片段

1)检查漂洗液是否按瓶身标签注明的,加入了指定体积的无水乙醇。

2)凝胶胶块溶胶不彻底,导致DNA没有释放出来,凝胶附在吸附柱表面致使回收率极低,甚至没有回收片段。

3)上样的DNA总量较少。吸附柱总会残留部分DNA,如果上样量过少,回收到的DNA就会过少,甚至没有。

2. 回收率偏低

1)溶解DNA的缓冲液与吸附柱接触时,只有当溶液的pH 值处于酸性状态时,才能达到理想的吸附效果。溶

胶液的pH 值一般在6左右,而琼脂糖凝胶偏碱性。当胶块加入溶胶液后,溶胶液的pH 值必然会受到影响,如

果胶块过大时,pH 值升高就更大,DNA回收率就会降低。所以,尽可能降低胶块体积可以避免回收率偏低。

2)电泳缓冲液如果长时间使用,没有更换,其pH 值会偏高,将影响DNA 的吸附。请更换新的电泳缓冲液

后,再进行电泳,然后切胶。

3)回收的DNA片段的大小对回收率的影响也是差异较大的。一般情况下300-200bp以下的小片段,回收率就会下降,且片段越小,回收率降低越明显。大的DNA片段,比如4-5kb以上的,回收率也会下降明显。遇到类似片段时,

1. 增加回收总量;

2. 将2-3管溶胶液并入一个吸附柱;

3. 洗脱液进行数次循环洗脱
4)洗脱体积偏少时,回收率会明显降低。可以根据试剂盒说明书的要求加入合适的洗脱体积。

在进行洗脱前,将洗脱液于30~60℃温浴,可提高洗脱效率。

5)胶块体积加入偏大或是溶胶不彻底都可能使回收率极大降低。降低胶块体积或是增加溶胶液体积,同时彻

底溶胶会改善回收率。


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