全基因合成常见问题（二）

Q12. 什么样的基因是复杂基因? 

    低GC含量序列：低GC含量的基因序列一般是指全长GC含量低于20%的基因，或100bp以内GC含量少于10%的序列；对于低GC片段，不包含发卡结构、反义互补、重复等其它复杂结构，一般将其分割成200bp/段来合成，然后通过合适的内切限制酶酶切后连接（常用BsaI和BpiI，所以序列本身最好不含有这两种酶切识别序列），这样更易得到正确的克隆，但是发货期将比正常序列更长一些，而且价格也比常规基因稍贵。一般低GC序列都可以合成并可通过测序验证。

    高GC含量：高GC序列一般是指GC含量高于70%的序列或100bp以内GC含量高于80%的序列；与低GC序列不同，高GC序列难于测序，所以GC>75%的序列合成业务，请特别询价，对于此类序列也需要将其分割成300bp的片段来合成，需要合适的内切限制酶，如BsaI 和 BpiI。

    反义互补重复序列：由于此类结构序列也不易于测序，所以我们一般不不承接反义互补重复序列合成业务。

    复杂基因与常规基因相比，合成费用较高，合成时间相对延长。对于复杂基因，可通过密码子优化，尽量减少基因序列中的重复序列，高GC%区和二级结构区。

Q13. 客户收到的基因为什么质粒切不动，或切不全?

    可能原因如下：

    (1) 质粒上酶识别序列不正确或者没有；

    (2) 酶切反应条件不合适；

    (3) 限制性内切酶对DNA甲基化敏感；

    (4) 内切酶稀释不正确或加入方法不正确；

    (5) 甘油浓度过高；

    (6) 限制性内切酶已部分或全部失活；

    (7) 保护碱基引入导致侧翼链锁死酶切位点。

    对策：

    (1) 检查质粒DNA中是否存在可被限制酶识别的DNA序列。

    (2) 优化酶反应体系，使用随酶提供的反应缓冲液；增大酶量或更换新酶。

    (3) 检查DNA是否已被甲基化，所用的酶是否对甲基化敏感。

    (4) 更换保护碱基，或PCR扩增目的片段，酶切PCR产物。

Q14. 如何运输以及保存质粒及其菌株?

    我们为您提供含有完全正确的基因序列的质粒（不少于5ug）两管。质粒可常温运输，溶解后需－20℃保存，并尽量避免反复冻融。

Q15. 客户提供样品做相关服务时，送样要求有哪些？

     质粒样品，可以是穿刺菌、甘油菌、冻干质粒或质粒溶液等形式。

    (1) 穿刺菌：请提供穿刺培养的单克隆菌落。穿刺培养的菌可以长时间保存而不会导致质粒的拷贝数明显下降。样品请在1.5ml或2ml的Eppendorf管中加入相应抗生素的固体LB培养基，然后将单菌落用牙签穿刺于LB固体培养基中。

    (2) 菌液：请将过夜培养的菌液加灭菌甘油至终浓度20%保存于1.5ml或2ml的Eppendorf管中，注意封口，以免污染。

    (3) 质粒：请提供3-5ug溶于无菌去离子水的质粒溶液或者抽干质粒。

    (4) 注意：

     a.请将装有样品的Eppendorf 管口用封口膜封紧，防止运输途中开盖导致样品污染或者丢失。

     b.请在管壁上注明质粒名称及抗性。

     c.载体其他信息请以邮件或便签等形式告知。