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细菌基因组DNA提取常见问题

关注:125 发表时间:2020-02-24 00:00:00

细菌基因组DNA提取常见问题

Q-1 基因组DNA得率低或无基因组DNA

A-1 一般情况下,从100ul-1ml过夜培养的大肠杆菌中,可以提取1-10ug的基因组DNA,推荐的菌液量是用500ul的过夜培养的浓菌液。我们不建议用过多的菌液,可能导致溶液不足而降低所提DNA的质量。基因组DNA得率较低时可从一下几个方面考虑:

    1.DNA未充分释放,保证在TE中充分悬浮菌体,注意不要残留菌体,加入Digestion Solution充分混匀。

    2.溶菌酶失活,溶菌酶要用附带的SP buffer配制,用水或碱性的TE配置的溶菌酶不能长期保存。配制好的溶菌酶最好分装成小份于-20℃保存。

    3.Proteinase K失活,proteinase K起到酶解细菌的作用,该酶失活后细菌裂解效率将大大降低。

    4.洗脱时将灭菌水或Elution Buffer 加热至65℃后使用将有利于提高洗脱效率。

    5.严格按照操作方法进行操作有利于提高基因组DNA得率。

Q-2 提取的基因组DNA有降解,为什么?

A-2 1.确认选用的培养菌体是否新鲜,如果菌体需要保存时,请于-80℃保存

    2.起始菌液量过多,导致菌液裂解不充分,部分DNA降解。

    3.菌体本身富含DNA酶活性,加入Digestion solution后再补加20ul 0.5M EDTA溶液来抑制内源性核酸酶。

Q-3 提取的DNA中有RNA污染,为什么?

A-3 1.一般提取基因组DNA过程中,RNA残留已经很少了,如果需要减少提取DNA中的RNA含量,有必要在消化步骤中加入4ul RNase A。

    2. RNase A可能失活。RNase A一般比较稳定,不易失活。如果确认是RNase A长期保存等原因导致其活性丧失,可以用实验室中已有的RNase A替代试剂盒中的RNase A。

Q-4 提取的基因组DNA生物活性差,为什么?

A-4 1.提取的基因组DNA中盐分浓度过高,请严格按照说明书操作。

    2. 提取的基因组DNA中含有乙醇。离心的速度和时间应该严格遵循说明书要求进行。

Q-5 能否用本试剂盒提取酵母中的基因组DNA?

A-5 不能,酵母属于真核生物,其细胞壁的化学组成和结构与细菌不同,因此Lysozyme不能使其细胞壁溶解,所以,本试剂盒不能提取酵母中的基因组DNA。如果需要提取酵母基因组DNA,请用酵母提取试剂盒(GK1091/GK1092)。

Q-6 本试剂盒是否适用于任何菌体基因组DNA的提取?

A-6 不一定。有些细菌的细胞壁的结构比较特殊,使用Lysozyme进行溶菌,其基因组DNA不能有效的释放出来。比如Staphylococcus Aureus 等革兰氏阳性菌便无法使用本试剂盒提取基因组DNA。


 

  

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