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引物合成常见问题

关注:201 发表时间:2020-02-26 00:00:00

引物合成常见问题

1.引物是如何合成的?

目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。DNA合成仪有很多种,无论采用什么机器合成,合成的原理都相同,主要差别在于合成产率的高低,试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。

1) 去保护:加入Deblocking脱去碱基上5'- OH的保护基团 DMT ,获得游离的 5'- OH; 

2) 耦合:同时加入活化剂和新的碱基,新的碱基 5'- OH仍然被 DMT 保护,3' 端被活化与溶液中游离的 5'- OH发生耦合反应;

3) 封闭:耦合反应中极少数 5'- OH没有参加反应 ,用封闭试剂终止其后继续发生反应;

4) 氧化:加入氧化剂使其由核苷亚磷酸酯形成更稳定的核苷磷酸酯。

合成后处理:

切割与脱保护基:将合成好的寡核苷酸链从支持物上化学切割下来。常用新鲜的浓氨水来裂解CPG与初始核苷之间的酯键。断裂下来的寡核苷酸带有自由的3’羟基。

纯化:根据所合成寡核苷酸的组成和应用来选定纯化的方法。常用的纯化方法有:C18、OPC、PAGE和HPLC。

定量:根据寡核苷酸在260nm处的紫外吸收来定量。

储存:分装抽干。

2.引物纯化方式有哪些,如何选择?

◆ C18柱脱盐:又称简易反相柱,它对DNA有特异性的吸附,可以被有机溶剂溶解洗脱,但不会被水洗脱,所以能有效地去除盐分。它不能有效去除比目的片段短的小片段。实际上,它是一种脱盐的作用。这种方法一般不会对普通PCR反应产生影响。对于需要用于测序、克隆的引物不能使用这个级别。    

◆ OPC纯化: OPC纯化是根据DNA保护基(DMT基)和树脂间的亲合力作用的原理进行纯化目的DNA片段。OPC法纯化的DNA纯度大于95%。适用于45base以下引物的纯化。

◆ PAGE纯:  PAGE纯化法是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,对DNA片段进行分离,然后从凝胶中回收目的DNA的方法。PAGE纯化法也是一种非常有效的DNA纯化方法,纯化后的DNA纯度大于95%,对长链Oligo DNA (大于45mer)的纯化特别有效。 

◆ HPLC纯化:HPLC纯化是使用高效液相色谱的原理,对DNA片段进行纯化。纯度可以大于99%。主要用于短链和修饰引物的纯化。该法的弱点是成本较高,批量生产效率不高。

◆ F-PAGE纯化:利用高分子惰性聚合分子作为合成载体,合成缩合率较高,有效减少了失败条带。经过后续的脱盐实验,能够去除铵盐等杂质,适用于大部分实验要求。F-Page纯化具有合成效率及纯度高,合成时间更短等显著特点。

3.合成的引物5’端是否有磷酸化?

合成的引物5’为羟基,没有磷酸基团。如果需要您可以用多核苷酸激酶进行5’端磷酸化,或者要求我们合成时直接在5’或3’端进行磷酸化,需要另外收费。

4.需要什么级别的引物?

答:根据实验需要,确定订购引物的纯度级别。

应用

引物长度要求

纯度级别要求

一般PCR扩增

< 45base

OPC,F-PAGE


>45 base

PAGE

诊断PCR扩增

< 40base

OPC,F-PAGE,PAGE

DNA测序

20base左右

OPC,F-PAGE

亚克隆,点突变等

根据实验要求定

OPC,F-PAGE,PAGE,HPLC

基因构建(全基因合成)

根据实验要求定

PAGE

反义核酸

根据实验要求定

PAGE

修饰引物

根据实验要求定

PAGE, HPLC

5.需要合成多少OD数?

答:根据实验目的确定。一般PCR扩增,2 OD引物,可以做200-500次50ul标准PCR反应。如果是做基因拼接或退火后做连接,1 OD就足够了。

6.如何计算引物的浓度?

答:引物保存在高浓度的状况下比较稳定。一般情况下,我们建议将引物的浓度配制成100pmol/ul,称为保存浓度,而引物的工作浓度一般配制成10-50pmol/ul。加水的体积(微升)可直接参照合成报告单上推荐的体积,也可按下列方式计算:

V (微升)= OD数x 33 x 10000 /引物的分子量

引物的分子量可以从合成报告单上获得。注意:1 OD260= 33 ug/ml。 

溶解前您需要核对合成报告单和引物标签上的引物OD数是否一致。如果不一致,请和我们联系。我们可以根据生产记录查到实际产量是多少。

7.如何计算引物的Tm值?

答:引物设计软件都可以给出Tm,与引物长度、碱基组成及所使用缓冲夜的离子强度有关。

长度为25base以下的引物,Tm计算公式为:Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T)

对于更长的寡聚核苷酸,Tm计算公式为:

Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (GC%) – 600/size         

公式中,Size = 引物长度。

8.引物(含修饰)的分子量是如何确定的?

答:非修饰的引物的分子量(MW)在随引物提供的报告单上可以找到。如果需要估计一个引物的分子量按每个碱基的平均分子量为324.5,引物的分子量=碱基数 x 碱基的平均分子量,或按下列公式计算MW= (NA * WA) + (NC * WC) + (NG * WG) + (NT * WT) +(Nmod * Wmod) +(Nx * Wx)+( NI* WI) +16* Ns–62. 

NA, NG, NC, NT, NI分别为引物中碱基A或G或C或T或I的数量,WA, WG ,WC, WT, WI分别为引物中碱基A或G或C或T或I的分子量,Nmod,Wmod 分别为修饰基团的数目和分子量。对于混合碱基的分子量为混合碱基的分子量总合除以混合数,例如G+A混合的分子量为(313.21+329.21)/2 = 321.21。Ns为硫代数目,硫代每个位置增加分子量16。

常规碱基分子量

Base

Molecular Weight 

A

313.21

C

289.18

G

329.21

T

304.19

I

314.2

U

290.17

常规修饰基团分子量

5’-Biotin

405.45

3’-TAMARA

623.60

5’-(6 FAM)

537.46

3’-Dabsyl

498.49

5’-HEX

744.13

3’-(6 FAM)

569.46

5’-TET

675.24

3’-Amino Modifier C3

153.07

5’-Cy5

533.63

3’-Amino Modifier C7

209.18

5’-Cy3

507.59

3’-Thiol Modifier C3

154.12

9.如何溶解引物?

答:干燥后的引物质地非常疏松,开盖前最好瞬时离心一下,或管垂直向上在桌面上敲敲,将引物粉末收集到管底。根据计算出的体积加入去离子无菌水或TE(pH8.0)缓冲液,室温放置几分钟,振荡助溶,离心将溶液收集到管底。溶解引物用的水一般不要用蒸馏水,因为有些蒸馏水的pH值比较低(pH4-5),引物在这种条件下不稳定。

10.如何保存引物?

答:引物合成后,经过一系列处理和纯化步骤,旋转干燥而成无色或白色絮状干粉。

   粉:运输时常温运输,-20℃可以保存一年。

储存液:配好后分装成几管,避免反复冻融,-20℃可以保存半年。

工作液:常规使用,4℃保存,也可-20℃保存,但应避免反复冻融。

修饰荧光引物:需要避光保存,尽快使用为宜。

11.引物定量不准是怎么回事儿?

答:我们偶尔收到用户投诉定量不准的报告,出现这种情况的可能性有:

1)定量错误、分装错误、引物抽干或收样过程中意外丢失。这种可能性有,但是很少,因为作为专业的引物合成公司,我们的生产人员都是经过严格的专业培训,这种错误是要求谨慎避免甚至杜绝的。一般情况下,引物都有留样备份,接到用户投诉后,我们都会找出留样重新定量,一般都没有问题,如确实存在问题,则可安排重新准备一份。

2)系统误差,我们认为10%左右为允许误差。使用过程中,引物工作浓度范围很宽,定量上的少许偏差不影响实验。

3)用户收到引物干粉时,打开引物管盖前没有离心或其他误操作导致引物干粉部分丢失。

4)用户没有能够正确理解引物OD数的含义,没有能够正确使用分光光度计,特别是使用微量测定;用户没有将OD读数,正确地转换成母液中OD数。这种情况比较常见。

   例如,验证标2OD引物量是否准确,简单的做法是: 加入1ml水,彻底溶解混匀后,取100ul, 加入900ul水,用光径为1cm的石英比色杯,波长260nm, 此时光吸收的读数为0.2。

12.最长可以合成多长的引物?

答:我们合成过120base的引物,但是产率很低。除非需要,建议合成片段长度不要超过80base。引物越长,出现问题的概率就越大,按照目前的引物合成效率,大于80base的粗产品,全长引物的百分比不高,后续处理还有丢失很多,最后的产量是很低。

13.为什么修饰引物的产量要比一般引物低,价格要高?

答:主要因为是修饰单体稳定性较差,偶连时间长,效率低,最后得到的产量自然低于一般的引物。修饰引物通常需要PAGE或HPLC纯化,纯化过程损失大。修饰引物使用的原料是一般引物原料的几百倍,所以产品的价格也高。

14.引物片段退火后不能连接到载体上是什么问题?

答:连接反应需要引物的5’磷酸基团。如果需要将合成的引物退火直接连接相应的载体上,引物需要磷酸化。磷酸化的产物如果还不能连接载体上,需要检查载体的酶切效果,需要改善引物退火的条件。SiRNA分子具有特殊的对称结构,退火的难度较大,退火时需要提高退火温度。

15.如果测序发现引物突变,是否有补偿?该如何处理?

答:如果出现测序发现引物位置碱基错误的情况,我们可以免费重合一次,没有其他任何补偿或赔偿,不承担其他连带责任,这是国际行规。原因我们在前面已提到,化学合成效率不可能达到100%。

如果遇到这种情况,首先和我们联系,我们会检查合成序列是否和原始订单一致,如果确认引物合成序列没有输错,我们建议重新挑取克隆测序,您可能会找到正确克隆的。根据我们经验,40个碱基以下的引物,测1-2个克隆就可以了;40个以上的特别是用于全片段拼接合成的,就需要多测一些了。一般情况下,每个克隆突变的位点都不一样,正确的总是有的,就是如何找到它。您也可以要求我们将引物免费重合一次,不过重合的引物和第一次的引物一样,都可能含突变,不会因为重合的引物就减少您的遇到问题的几率。基因拼接过程中,如果发现一段区域突变点不多,就多测几个,否则就重合一下引物。

16.引物是经过PAGE纯化的,为什么还有碱基缺失或插入?

答:理论上分析型PAGE变性电泳,可以区分引物之间一个碱基的差别。但是如果客户对长引物的量要求比较高,为保证引物的量,制备PAGE电泳,上样量都是非常大,电泳时的条带非常宽,带与带之间有重叠,分辨率已下降,电泳后割带回收目的引物时,很难说不割到差别仅几个碱基的引物。建议:减少OD数,引物遇到的问题可能就会少一些。

17.为什么引物的OD260/OD280小于1.5 ?

答: 需要指出的是OD260/OD280的比值不能用来衡量引物的纯度。OD260/OD280的比值过低一般是由于引物中C/T 的含量比较高所致。下表是一个20base 同聚体引物的OD260/OD280的比值,清楚表明OD260/OD280的比值与引物的碱基组成密切相关。

A260/280 ratios of Crude 20-mer Oligos of Differing Base Compositions

Base Composition

A260/280

5-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3

2.50

5-GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG-3

1.85

5-CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC-3

1.15

5-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3

1.14

5-AAAAAGGGGGTTTTTCCCCC-3

1.66

18.同样的OD用PAGE检测,EB染色为什么深浅不一?

答:通常可以用EB染色的方法来判断双链DNA的量(如质粒DNA),因为EB可以嵌合到双链DNA中。而合成的单链DNA,由于碱基组成不同,形成二级结构的可能性不同,EB的染色程度也会有差异,比如Oligo(dT)等不形成二级结构,EB染色效果就非常差。所以不要用EB染色的方法来定量,而用紫外分光光度计检测。

19.如何检测引物的纯度?

答:实验室方便的做法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。取0.2-0.5OD的引物,用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和,上样前加热变性(95℃,2mins)。加入尿素的目的一是变性,二是增加样品比重,容易加样。600V电压进行电泳,一定时间后(约2-3小时),剥胶,用荧光TLC板在紫外灯下检测带型,在主带之下没有杂带,说明纯度是好的。如果条件许可,也可以用银染方式染色。

21.已经溶解的引物,为什么原先使用正常,而过一段时间再使用就不好了?

答:如果您溶解引物的水pH过低或污染了菌或核酸酶,会使引物降解。使用时没有充分解冻混合,液体不均匀也可能会造成引物加入量不准确。建议分装引物,避免反复冻溶。建议使用10mM Tris pH7.5缓冲液溶解引物,因为有些蒸馏水的pH值比较低(pH4-5), 引物在这种条件下不稳定。还有一种可能性是引物没有问题,而是PCR使用材料特别是模板的质量与先前使用的不完全一致。

22.引物是我们设计的,现在您扩不出来,我们要负责吗?

答:不承担相关责任。我们为一些实验经验不足的客户,免费设计引物,提供一定的便利。我们遵循一般的引物设计原则设计好引物之后都会发给您确认,而后再安排合成并保证引物质量。但是设计的引物是否能够满足您的实验要求,一定扩增出您需要的基因片段,谁也不能100%保证。

23.PCR扩增无目的片段是引物质量有问题吗?

答:PCR扩增无目的条带或者非特异性扩增,影响因素是多方面的,需要耐心地分析,如模板结构与质量、反应条件、引物设计等等。当今发展出各色各样的PCR扩增技术,各色各样的高温聚合酶,就是来解决PCR扩增中遇到的扩不出,扩增效率低的问题。如巢式PCR就是扩增拷贝数很低的基因片段。通过提高模板质量、优化反应条件等方面找到对策,或者有必要时重新设计引物,最好在实验时设置对照来判定原因如果您怀疑引物的问题,请您首先测定您溶解的引物的OD值,看实验时加入的引物量是否正确。如果量是正常的,请您告诉我司您的引物编号,我们会复查留存样品。如不明原因,我们免费为您重新合成一次。如果仍然不能扩增,请您查找其它原因。多数情况下我们复检引物质量都没有问题,因为我们在引物出售前已经严格把好质量关。

24. 常用荧光染料参数

染料

Excitation 
(激发波长, nm ) 

Emission 

(发射波长, nm )

颜色

6-FAM

494

518

Yellow-green

Fluorescein

495

520

TET

521

536

JOE

520

548

Yellow

HEX

533

559

CY3

550

570

Yellow-orange

TAMRA

544

576

ROX

576

601

Orange

Cy5

650

670

Red

注:关于猝灭基团的选择,一般是报告基团的发射光在猝灭基团的吸收波长内。


 

  

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