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引物和探针的实验要求

关注:118 发表时间:2020-02-20 00:00:00

引物和探针的实验要求
    PCR是分子生物学实验中最常使用的实验方法。引物和探针的设计是实验者进行PCR扩增时必须要了解的一个知识点。
1.  由于引物原因导致PCR扩增有非特异性扩增
    引物特异性差是PCR有非特异性扩增的一个主要原因。特别是模板为基因组等复杂模板时,对引物设计有较高要求。可以通过:
1)提高退火温度;
2)选择模板其它区域重新设计引物;
3)如果是做染料法荧光定量PCR的,引物纯化方式要为Page,HPLC等纯化级别。
2.  PCR扩增后有引物二聚体
    染料法荧光定量PCR对引物设计上要求较高。
1)引物结构上不能有较严重的二聚体及发夹结构;
2)PCR体系中引物浓度一般在0.1um-1um,一般为0.2um。如果引物浓度要求更低,可以尝试在0.05um-0.1um;
3)提高退火温度。.
3.  荧光定量PCR的引物设计要求
1)引物GC含量尽可能在40%-60%,Tm值最好取60℃左右;
2)避免引物自身或与引物之间形成4个或以上连续碱基配对,同时没有形成发夹结构;
3)引物长度在20-30bp;
4)目的片段长度一般设计为100-200bp;
5)引物特异性要较高。
4.  Taqman探针的设计要求
1)Tm值最好在65-70℃(MGB探针可以降低Tm值);
2)探针的5’端应避免碱基G;
3)探针长度最好在20-30bp;
4)探针尽可能的靠近引物位置;
5)保证探针的高度特异性。


 

  

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