引物合成常见问题解答
作者：上海捷瑞生物工程有限公司
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发表时间：2020-03-02 14:20:08
引物是如何合成的
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目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。DNA合成仪有很多种,无论采用什么机器合成，合成的原理都相同，主要差别在于合成产率的高低，试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。
(1) 去保护：加入Deblocking脱去碱基上5'- OH的保护基团DMT，获得游离的5'- OH；
(2) 耦合：同时加入活化剂和新的碱基，新的碱基5'-OH仍然被DMT保护，3'端被活化与溶液中游离的5'-OH发生耦合反应；
(3) 封闭：耦合反应中极少数5'- OH没有参加反应，用封闭试剂终止其后继续发生反应；
(4) 氧化：加入氧化剂使其由核苷亚磷酸酯形成更稳定的核苷磷酸酯。
引物合成后如何处理
切割与脱保护基：将合成好的寡核苷酸链从支持物上化学切割下来。常用新鲜的浓氨水来裂解CPG与初始核苷之间的酯键。断裂下来的寡核苷酸带有自由的3'羟基。
纯化：根据所合成寡核苷酸的组成和应用来选定纯化的方法。常用的纯化方法有：C18、OPC、PAGE和HPLC。
定量：根据寡核苷酸在260nm处的紫外吸收来定量。
储存：分装抽干。
需要什么级别的引物
根据实验需要，确定订购引物的纯度级别。
应用 引物长度要求 纯度级别要求
一般PCR扩增 < 60base OPC >60 base PAGE
诊断PCR扩增 < 40base OPC, PAGE
DNA测序 20base左右 OPC
亚克隆，点突变等 根据实验要求定 OPC PAGE，HPLC
基因构建（全基因合成） 根据实验要求定 OPC PAGE
反义核酸 根据实验要求定 OPC PAGE
修饰引物 根据实验要求定 PAGE, HPLC
如何计算引物的Tm值
引物设计软件都可以给出Tm，与引物长度、碱基组成及所使用缓冲夜的离子强度有关。
长度为25base以下的引物，Tm计算公式为：Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T)
对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为：
Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (GC%) - 600/size
＊公式中，Size =引物长度。
引物的质量是不是和序列有关？
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四种碱基的性质和各自保护基的性质都有差别。所以合成难度是不一样的。难度最大的当属GC重复多的和序列中还有多个连续的G的引物。尤其对于后者，一般公司都做不了20个G以上的引物。实验证明，如果引物中有超过三个连续G的结构，传统方法得到的产物质量就会开始下降。而且目前通用的脱盐、OPC和PAGE方法都无效。
如何保存引物
引物合成后，经过一系列处理和纯化步骤，旋转干燥而成无色或白色絮状干粉。
干 粉：运输时常温运输，-20℃可以保存一年。
储存液：配好后分装成几管，避免反复冻融，-20℃可以保存半年。
工作液：常规使用，4℃保存，也可-20℃保存，但应避免反复冻融。
修饰荧光引物：需要避光保存，尽快使用为宜。
