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引物合成常见问题解答

浏览:206 发表时间:2020-03-02 14:20:08
引物合成常见问题解答


引物是如何合成的

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目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。DNA合成仪有很多种,无论采用什么机器合成,合成的原理都相同,主要差别在于合成产率的高低,试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。

(1) 去保护:加入Deblocking脱去碱基上5'- OH的保护基团DMT,获得游离的5'- OH;

(2) 耦合:同时加入活化剂和新的碱基,新的碱基5'-OH仍然被DMT保护,3'端被活化与溶液中游离的5'-OH发生耦合反应;

(3) 封闭:耦合反应中极少数5'- OH没有参加反应,用封闭试剂终止其后继续发生反应;

(4) 氧化:加入氧化剂使其由核苷亚磷酸酯形成更稳定的核苷磷酸酯。

引物合成后如何处理

切割与脱保护基:将合成好的寡核苷酸链从支持物上化学切割下来。常用新鲜的浓氨水来裂解CPG与初始核苷之间的酯键。断裂下来的寡核苷酸带有自由的3'羟基。

纯化:根据所合成寡核苷酸的组成和应用来选定纯化的方法。常用的纯化方法有:C18、OPC、PAGE和HPLC。

定量:根据寡核苷酸在260nm处的紫外吸收来定量。

储存:分装抽干。

需要什么级别的引物


根据实验需要,确定订购引物的纯度级别。

应用 引物长度要求 纯度级别要求 

一般PCR扩增 < 60base OPC >60 base PAGE 

诊断PCR扩增 < 40base OPC, PAGE 

DNA测序 20base左右 OPC 

亚克隆,点突变等 根据实验要求定 OPC PAGE,HPLC 

基因构建(全基因合成) 根据实验要求定 OPC PAGE 

反义核酸 根据实验要求定 OPC  PAGE 

修饰引物 根据实验要求定 PAGE, HPLC 


如何计算引物的Tm值

引物设计软件都可以给出Tm,与引物长度、碱基组成及所使用缓冲夜的离子强度有关。

长度为25base以下的引物,Tm计算公式为:Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T)

对于更长的寡聚核苷酸,Tm计算公式为:

Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (GC%) - 600/size

*公式中,Size =引物长度。



引物的质量是不是和序列有关?

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四种碱基的性质和各自保护基的性质都有差别。所以合成难度是不一样的。难度最大的当属GC重复多的和序列中还有多个连续的G的引物。尤其对于后者,一般公司都做不了20个G以上的引物。实验证明,如果引物中有超过三个连续G的结构,传统方法得到的产物质量就会开始下降。而且目前通用的脱盐、OPC和PAGE方法都无效。


如何保存引物

引物合成后,经过一系列处理和纯化步骤,旋转干燥而成无色或白色絮状干粉。

干 粉:运输时常温运输,-20℃可以保存一年。

储存液:配好后分装成几管,避免反复冻融,-20℃可以保存半年。

工作液:常规使用,4℃保存,也可-20℃保存,但应避免反复冻融。

修饰荧光引物:需要避光保存,尽快使用为宜。


友情链接:http://www.hstbio.cn

 

  

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