一、pri-miRNA、pre-miRNA、miRNA基因名称怎么填写？

初级miRNA（primary miRNA，pri-miRNA）由miRNA基因（通常位于基因间或内含子区域）转录产生（图一）。pri-miRNA长度约为300-1000bp，通常具有5’帽结构、3’polyA尾结构。暂无pri-miRNA数据库，客户必须自行提供序列，基因名称可自行定义，无要求。

pri-miRNA在细胞核内被Drosha核酸内切酶切割，成为单发夹结构的前体miRNA（precursor miRNA，pre-miRNA）。pre-miRNA长度大约为70~90bp，在转运蛋白Esportin-5的作用下由细胞核内转运到细胞质中。pre-miRNA即为NCBI收录的miRNA基因转录产物，命名为MIR21（microRNA 21，NCBI正式名称为全大写字母加数字）。设计pre-miRNA的引物，请填写全大写正式基因名，如MIR21、MIR125A。

pre-miRNA在细胞质中被Dicer核酸内切酶切割成~24bp双链RNA。双链miRNA片段装入RISC（RNA-induced silencing complex）后，miRNA反义链被降解。含有成熟miRNA（microRNA，约20-24bp）的RISC与靶mRNA结合，引起靶mRNA降解或者翻译抑制。设计miRNA的引物，请填写全小写正式名称，如hsa-miR-21-5p、mmu-miR-199b-3p（hsa、mmu为物种前缀，5p、3p为miRNA的方向标识）。

图一、miRNA成熟过程[1]。

二、miRNA基因编号在哪里，需要填写吗？

例如：MIR21（正式名称）、hsa-mir-21、miR-21均表示pre-miRNA。基因编号可直接搜索NCBI官网（图二），查看Gene ID为406991，非必填。

成熟miRNA是由pre-miRNA剪切产生。基因编号同pre-miRNA，非必填。

图二、NCBI搜索miRNA基因编号[2]。

三、miRNA定量方法选择茎环法和加尾法，引物有区别吗？

茎环法和加尾法均需经过反转录、qPCR两个实验步骤，主要区别在于反转录使用的引物不同。茎环法使用stemloop specific primer（茎环特异性引物）进行反转录，加尾法使用polyT引物进行反转录（图三，a）。

qPCR步骤的正向引物相同，均为miRNA特异性引物。但是反向引物不同，茎环法的通用反向引物为茎环的部分序列，加尾法的通用反向引物为polyT引物（图三，b）。miRNA引物设计默认会给出前后引物+茎环引物，如果客户使用加尾法，只需要合成前引物，后引物为试剂盒自带无需设计合成。

图三、miRNA茎环法与加尾法[3]。

四、miRNA引物设计之后，是否直接合成，需要怎么检查？

miRNA引物设计后，客户可自行核对前引物。前引物一般截取miRNA的前面15-18bp，在5’端加GC碱基调节Tm值。后引物及茎环序列为固定序列，无需核查。

五、miRNA实验步骤以及注意事项？

本手册为引物设计注意事项。实验步骤详见产品说明书（产品会附送纸质版）。

六、联系方式

电话：15692161596（微信）

邮件：service@generay.com.cn

参考文献：

[1]Motameny S, Wolters S, Nürnberg P, Schumacher B. Next Generation Sequencing of miRNAs - Strategies, Resources and Methods. Genes (Basel). 2010;1(1):70-84. Published 2010 Jun 3. doi:10.3390/genes1010070

[2]https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/?term=MIR21

[3]Jet T , Gines G , Rondelez Y , Taly V . Advances in multiplexed techniques for the detection and quantification of microRNAs. Chem Soc Rev. 2021;50(6):4141-4161. doi:10.1039/d0cs00609b