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| 1. 引物是如何合成的？ |
| 目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。 DNA 合成仪有很多种 , 主要都是由 ABI/PE 公司生产，无论采用什么机器合成，合成的原理都相同，主要差别在于合成产率的高低，试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。 |
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| 亚磷酰胺三酯法合成 DNA 片段，具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。亚磷酰胺三酯法是将 DNA 固定在固相载体上完成 DNA 链的合成的，合成的方向是由待合成引物的 3' 端向 5' 端合成的，相邻的核苷酸通过 3'→5' 磷酸二酯键连接。 |
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| 第一步是将预先连接在固相载体 CPG 上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其 5'- 羟基的保护基团 DMT ，获得游离的 5'- 羟基； |
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| 第二步，合成 DNA 的原料，亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的 3' 端被活化， 5'- 羟基仍然被 DMT 保护，与溶液中游离的 5'- 羟基发生缩合反应。 |
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| 第三步，带帽 (capping) 反应，缩合反应中可能有极少数 5'- 羟基没有参加反应 ( 少于 2%) ，用乙酸酐和 1- 甲基咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在纯化时分离掉。 |
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| 第四步，在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。 |
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| 经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。再以三氯乙酸脱去它的 5'- 羟基上的保护基团 DMT ，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去。合成过程中可以观察 TCA 处理阶段的颜色判定合成效率。 |
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| 通过氨水高温处理，连接在 CPG 上的引物被切下来，通过 OPC, PAGE 等手段纯化引物，成品引物用 C18 浓缩 , 脱盐，沉淀。沉淀后的引物用水悬浮，测定 OD260 定量，根据定单要求分装。 |
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| 2. 引物纯化方式有哪些，如何选择？ |
| ◆C18 柱脱盐：有人称其为简易反相柱，它对 DNA 有特异性的吸附，可以被有机溶解洗脱，但不会被水洗脱，所以能有效地去除盐分。它不能有效去除比目的片段短的小片段。实际上，它是一种脱盐的作用。这种方法一般不会对普通 PCR 反应产生影响。对于需要用于测序、克隆的引物不能使用这个级别。 |
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| ◆OPC 纯化： OPC 纯化是根据 DNA 保护基（ DMTr 基）和 Cartridge 柱中树脂间的亲合力作用的原理进行纯化目的 DNA 片段。 OPC 法纯化的 DNA 纯度大于 95% 。适用于 40mer 以下引物的纯化。 |
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| ◆PAGE 纯： PAGE 纯化法是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，对 DNA 片段进行分离，然后从凝胶中回收目的 DNA 的方法。 PAGE 纯化法也是一种非常有效的 DNA 纯化方法，纯化后的 DNA 纯度大于 95% ，对长链 Oligo DNA ( 大于 50mer) 的纯化特别有效。 |
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| ◆HPLC 纯化： HPLC 纯化是使用高效液相色谱的原理，对 DNA 片段进行纯化。纯度可以大于 99% 。主要用于短链和修饰引物的纯化。该法的弱点是成本较高，批量生产效率不高。 本公司现在 OPC 与 HPLC 两种纯化方式供你选择。 |
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| 3. 引物的 OD 数如何定量？ |
| 答：引物合成引物 OD 数是这样测定的：用紫外分光光度计，波长 260nm ，石英比色杯，光程为 1 厘米 ，测定溶液的光密度。测定时溶液的光密度最好稀释到 0.2-1.0 之间。 DNA 干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后，用 1ml 水稀释测 OD 值。需要根据稀释倍数换算出母液的 OD 值。 |
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| 4. 投诉定量不准是怎么回事儿？ |
| 答：我们偶尔收到用户投诉定量不准的报告，出现这种情况的可能性有（ 1 ）生产人员定量错误。这种可能性有，但是不大，因为我们的生产人员都是经过严格的培训，程序化规范操作和换算。公司内部的考核机制也使得分装人员没有必要故意少给用户 OD 数，因为无论 OD 数是否达到定单要求，我们都统计为工作量，没有达到 OD 数的，分装人员将清单及时报到序列录入部门安排重合就可以了。合成产量的高低是序列录入部门人员的考核指标之一。一般情况下，引物都有留样。接到用户投诉后，我们都会找出留样重新定量，一般都没有问题。（2）分装没有问题，但引物抽干或收样过程中，引物干粉可能意外丢失。这种情况很少见。（ 3 ）系统误差，我们认为 10% 左右为允许误差。使用过程中，引物工作浓度范围很宽，定量上的少许偏差不影响实验。（ 4 ）用户没有能够正确理解引物 OD 数的含义，没有能够正确使用分光光度计，特别是使用微量测定；用户没有将 OD 读数，正确地转换成母液中 OD 数。这种情况比较常见。（ 5 ）用户收到引物干粉时，打开引物管盖前没有离心或其他误操作导致引物干粉部分丢失。 |
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| 例如，验证标 2OD 引物量是否准确，简单的做法是： 加入 1ml 水，彻底溶解混匀后，取 100ul, 加入 900ul 水，用光径为 1cm 的石英比色杯，波长 260nm, 此时光吸收的读数为 0.2 。 |
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| 5. 需要什么级别的引物？ |
| 答：引物常用的纯化方式 C18 脱盐， OPC 纯化， PAGE 纯化， HPLC 纯化。根据实验需要，确定订购引物的纯度级别。 |
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应用 |
引物长度要求 |
纯度级别要求 |
一般 PCR 扩增 |
< 45base |
OPC |
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>45 base |
PAGE |
诊断 PCR 扩增 |
< 40base |
OPC, PAGE |
DNA 测序 |
20base 左右 |
OPC |
亚克隆，点突变等 |
根据实验要求定 |
OPC, PAGE ， HPLC |
基因构建（全基因合成） |
根据实验要求定 |
PAGE |
反义核酸 |
根据实验要求定 |
PAGE |
修饰引物 |
根据实验要求定 |
PAGE, HPLC |
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| 合成片段长度不要超过 80mer, 按照目前的引物合成效率， 80mer 的粗产品，全长（还不一定正确）引物的百分比不会超过 40% ，后续处理还有丢失很多，最后的产量是很低。 |
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7. 需要合成多少 OD 数？
答：根据实验目的确定。一般 PCR 扩增，2OD 引物，可以做 200-500 次 50ul 标准 PCR 反应。如果是做基因拼接或退火后做连接， 1 OD 就足够了。但是有些研究人员，就做几次 PCR ，但是却要 5-10 OD 。做全基因构建的引物都比较长，但是我们有些研究人员也要求高 OD 数。片段越长 , 最后全长得率就越低，出错的几率就越大。超出需要之外的 OD 数要求，其实也是对社会资源的一种浪费，同时也从一个侧面反映了部分研究人员，特别是新手的自信心不足，总觉得需要重复多次才能成功。 |
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9. 如何计算引物的浓度？
答：引物保存在高浓度的状况下比较稳定。引物一般配制成 10-50pmol/ul 。 溶解前您需要核对合成报告单和引物标签上的引物 OD 数是否一致。如果不一致，请和我们联系。我们可以根据生产记录查到实际产量是多少。
一般情况下，我们建议将引物的浓度配制成 50pmol/ul ，加水的体积（微升）按下列方式计算： V ( 微升 )= OD 数 * （乘） 33 * （乘） 20000 / ( 除 ) 引物的分子量 。引物的分子量可以从合成报告单上获得。如果需要配制成其他浓度，按上述公式换算。
注意： 1 OD260= 33 ug/ml. |
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10. 如何计算引物的 Tm 值？
答：引物设计软件都可以给出 Tm ，引物长度，碱基组成，引物使用缓冲的离子强度有关。
长度为 25mer 以下的引物， T m 计算公式为： T m = 4℃ (G + C)+ 2℃ (A + T)
对于更长的寡聚核苷酸， T m 计算公式为：
Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) – 600/size
公式中， Size = 引物长度。
Tm 的定义： Tm = Temperature at which 50% of a given oligonucleotide is hybridized to its complementary strand. In the absence of destabilizing agents, like formamide or urea, Tm will depend on 3 major parameters: The sequence: a GC-rich sequence has a higher melting temperature. The strand concentration: high oligonucleotide concentrations favor hybrid formation, which results in a higher melting temperature. The salt concentration: high ionic strength results in a higher Tm as cations stabilize the DNA duplexes. |
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11. 引物（含修饰）的分子量是如何确定的？
答：非修饰的引物的 Molecular Weight 在随引物提供的报告单上都有明确的标示。如果需要估计一个引物的分子量按每个碱基的平均分子量为 324.5 ，引物的分子量 = 碱基数 x 碱基的平均分子量。或按下列公式计算 MW= (NA * WA) + (NC * WC) + (NG * WG) + (NT * WT) +(Nmod * Wmod) ＋（ Nx * Wx ） +( Ni* Wi) +16* Ns– 62.
NA, NG, NC, NT, Ni 分别为引物中碱基 A 或 G 或 C 或 T 或 I 的数量， WA, WC, WG, W, Wi 分别为引物中碱基 A 或 G 或 C 或 T 或 I 的分子量， Nmod ， Wmod 分别为修饰基团的数目和分子量。
对于混合碱基的分子量为混合碱基的分子量总合除以混合数，例如 G+A 混合的分子量为（ 313.21+329.21 ） /2 = 321.21 。 Ns 为硫代数目，硫代每个位置增加分子量 16 。 |
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| 常规碱基分子量 |
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Base |
Molecular Weight |
A |
313.21 |
C |
289.18 |
G |
329.21 |
T |
304.19 |
I |
314.2 |
U |
290.17 |
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| 常规修饰基团分子量 |
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5' -Biotin |
405.45 |
3' -TAMARA |
623.60 |
5' -(6 FAM) |
537.46 |
3' -Dabsyl |
498.49 |
5' -HEX |
744.13 |
3' -(6 FAM) |
569.46 |
5' -TET |
675.24 |
3' -Amino Modifier C3 |
153.07 |
5' -Cy5 |
533.63 |
3' -Amino Modifier C7 |
209.18 |
5' -Cy3 |
507.59 |
3' -Thiol Modifier C3 |
154.12 |
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