上海捷瑞生物工程有限公司

首页 > 产品目录

12. 如何溶解引物？

答：干燥后的引物质地非常疏松，开盖前最好离心一下，或管垂直向上在桌面上敲敲，将引物粉末收集到管底。根据计算出的体积加入去离子无菌水或 10mM Tris pH7.5 缓冲液，室温放置几分钟，振荡助溶，离心将溶液收集到管底。溶解引物用的水一般不要用蒸馏水，因为有些蒸馏水的 pH 值比较低（ pH4-5 ） , 引物在这种条件下不稳定。

13. 如何保存引物？

答：引物合成后，经过一系列处理和纯化步骤，旋转干燥而成片状物质。引物在溶解前，室温状态下可以长期保存。溶解后的引物 -20 度可以长期保存。如果对实验的重复性要求较高，合成的 OD 数较大，建议分装，避免反复冻融。修饰荧光引物需要避光保存。

14. 合成的引物 5' 端是否有磷酸化

答：合成的引物 5' 为羟基，没有磷酸基团。如果需要您可以用多核苷酸激酶进行 5' 端磷酸化，或者要求我们合成时直接在 5' 或 3' 端进行磷酸化，需要另外收费。

15. 引物片段退火后不能连接到载体上是什么问题？

连接反应需要引物的 5' 磷酸基团。如果需要将合成的引物退火直接连接相应的载体上，引物需要磷酸化。磷酸化的产物如果还不能连接载体上，需要检查载体的酶切效果，需要改善引物退火的条件。 SiRNA 分子具有特殊的对称结构，退火的难度较大，退火时需要提高退火温度。

16. 测序发现引物有突变是怎么回事？

答：测序发现引物区域有突变，特别是 40 个碱基以下的引物 , 发生的概率不大，但是肯定也会发生。用户一般可以放心，引物序列一般都是通过电脑直接将您的序列 COPY 到合成仪的，碱基输错的机会不多。我们有一套控制办法，预防碱基输入错误。发生这种突变的原因有很多解释，人们还没有办法彻底解决这个问题。引物合成的固相合成原理都一样，采用的机器也基本相同，合成主要原料都是由可数的几家跨国公司提供的，所有每个合成服务商遇到的问题也基本类似，没有人可以超脱。

引物合成是一种多步骤的化学反应，合成效率最高也就是 99% ，副产品不可以避免。引物序列中插入突变往往是碱基重复，一般认为，偶连过程中，正在偶连的部分单体发生丢失 DMT, 导致单体又接了上去，故发生插入同一碱基的突变。至于缺失突变，一般认为是一般认为是带帽 (capping) 反应不彻底造成的， Caping 反应主要是封闭极少数 5'- 羟基没有参加反应单体。被封闭的引物，在下一轮偶连时将不能继续参与合成。对于碱基置换的突变，产生的原因一般认为是碱基不能 100% 脱保护，即引物上可能含有残留保护基团，引物的这些区域不能很好地与互补链配对，当扩增的产品被亚克隆转化到大肠杆菌中，可能被细菌中修复系统补上了非配对的碱基。置换突变通常发生在 G 转换成其它碱基。碱基 G 在一定条件下可以转化为烯醇异构体（脱嘌呤）， 2,6 diaminopurine , DNA 复制和扩增过程中 DNA 聚合酶将 2,6 diaminopurine 看作碱基 A ，测序就会发现碱基 G-A 置换。脱嘌呤现象在富含嘌呤的引物中发生的频率较高。脱嘌呤的引物在引物后处理脱保护阶段如果被降解，测序就会发现碱基 G 或 A 的缺失。

引物合成过程中，造成碱基插入，缺失，置换突变的因素客观存在，有不少降低发生的频率建议和措施，但是这些措施还停留在实验室阶段，还没有能够应用到规模化生产中。

17. 长链引物为什么出错的几率非常高？
答：引物合成时，每一步反应效率都不能达到 100% ，产生碱基插入，缺失，置换突变的因素客观条件都有一直存在。引物链越长，突变的频率累加起来就越高。研究人员总希望合成的引物万无一失，这种心情可以理解。但是犹如 PCR 扩增，不可能绝对保证扩增产物中没有突变，引物合成也不可能保证 100% 正确。要知道，引物合成中发生错误（非人为因素）的频率，比任何高保真高温聚合酶 PCR 扩增过程所产生的频率都要高。做引物合成，长链引物合成，您要有引物中部分引物可能有突变的思想准备。

18. 如果测序发现突变，该如何处理？
　　答：对您遇到的困惑，我们表示同情。遇到这种情况，首先和我们取得联系，我们的生产人员会检查生产的原始记录，主要是核对合成序列是否和定单一致，我们在电脑中保留所有原始数据。如果确认引物合成序列没有输错，我们建议重新挑取克隆测序，您可能会找到正确克隆的。根据我们经验， 40 个碱基以下的引物，测 1-2 个克隆就可以了； 40 个以上的特别是用于全片段拼接合成的，就需要多测一些了。一般情况下，每个克隆突变的位点都不一样，提示正确的总是有的，就是如何找到它。您也可以要求我们将引物免费重合一次，不过重合的引物和第一次的引物一样，都可能含突变，不会因为重合的引物就减少您的遇到问题的几率。基因拼接过程中，如果发现一段区域突变点不多，就多测几个，否则就重合一下引物。

19. 如果测序发现引物突变，是否有补偿？
　　答：没有。我们可以免费重合一次，没有其他任何补偿或赔偿，不承担其他连带责任。原因我们在前面已提到，化学合成效率不可能达到 100% 。您选择了化学合成引物，合成过程中一些副产品所带来的后果就可能不可避免的遇到。

Top

20. 引物是经过 PAGE 纯化的，为什么还有碱基缺失或插入？
　　答：理论上分析型 PAGE 变性电泳，可以区分引物之间一个碱基的差别。但是制备 PAGE 电泳，上样量都是非常大，电泳时的条带非常宽，带与带之间有重叠，分辨率已下降，电泳后割带回收目的引物时，很难说不割到差别仅几个碱基的引物。国内有一个不好的现象， PAGE 纯化的引物，特别是长引物要的量都比较高，导致割的条带有时可能比较宽。建议：您如果减少 OD 数，引物遇到的问题可能就会少一些。

21. 为什么 OPC 或 PAGE 纯化的引物，再用 HPLC 鉴定纯度不高？

　　答：有些用户引物需要纯度特别高的引物，在使用前会将 HPLC 鉴定引物的纯度，常常发现引物的纯度一般在 70% 左右。问题来了，还有那 30% 是什么？引物纯化 PAGE, 需要电泳，用缓冲液将引物浸泡出来，然后用 C18 浓缩，乙醇沉淀。沉淀得到的核酸物质基本引物了，除此以外，还有其他一些非核酸类物质，他们一般不会干扰引物的使用。 OPC 纯化也类似的情况。即使是 HPLC 纯化的引物，如果对成品进行分析，一般也难达到很高的纯度，引物您得到的纯品都是由制备柱过来，洗脱峰经过浓缩抽干，部分非核酸物质被富集。

22. 为什么修饰引物的产量要比一般引物低，价格要高 ?

　　答：主要因为是修饰单体稳定性较差，偶连时间长，效率低，最后得到的产量自然低于一般的引物。修饰引物通常需要 PAGE 或 HPLC 纯化，纯化过程损失大。修饰引物使用的原料是一般引物原料的几百倍，所以产品的价格自然高。