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| 测序过程常见问题分析与解答。 |
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| 8、出现套峰的原因是什么？ |
| 答：在测序反应中，模板或引物的原因都可能造成套峰的形成，归结其形成原因有以下几点： |
（1）测序引物在模板上有两个结合位点（图5）；
（2）模板不纯，如果是质粒或是菌液，原因是非单克隆（图6），如果是PCR,原因为非特异性条带（图7）；
（3）模板序列的特殊结构，如poly结构、发卡结构等（图8）；
（4）引物降解，或引物不纯（图9，图10）。 |
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| 图5
双引物结合位点引起的套峰 |
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| 图6 由于质粒或菌液为非单克隆引起的套峰 |
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| 图7 PCR为非特异性条带引起的套峰 |
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| 图8 模板特殊结构引起的套峰 |
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| 图9 引物轻微降解或引物不纯引起的套峰 |
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| 图10 引物严重降解或引物不纯引起的套峰 |
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| 9、我为什么找不到我的PCR引物？ |
答：以下几种情况，我们将无法找到做PCR时的引物序列
（1）用PCR引物作为测序引物进行测序时，所测序列是从引物3’末端后第一个碱基开始的，所以自然就找不到您的引物序列了。有两种方法可以得到您的引物序列。对于较短的PCR产物（<800bp），可以用另一端的引物进行测序，从另一端测序可以一直测到序列的末端，就可以在序列的末端得到的引物的反向互补序列。对于较长的序列，一个测序反应测不到头，因此就只能将您的PCR产物片段克隆到适当的载体中，用载体上的通用引物进行测序。由于载体上的通用引物与您的插入序列之间有一段距离，因此就可以得到您的完整的引物序列。由于在测序的起始端总会有一些碱基无法准确读出，因此，您如果想得到您的PCR产物的完整序列，最好克隆后进行测序。
（2） PCR产物用T载体克隆后，由于克隆的方向是随机的，因此，当您在一条链上找不到您的引物序列时，试图在互补链上寻找您的引物序列。
（3）当测序引物离您的插入片段很近时，有时可能也无法找到您的引物的全序列。这主要是因为有时序的起始端由于未去除的染料或引物二聚体的干扰，造成起始区的序列不好，可能无法找到您的引完整序列。
（4）有时，质粒做模板进行测序时，由于某些原因，质粒上没有插入外援片段，为空载体，所测的序完全为载体序列，此时自然也找不到引物序列。 |
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| 10、我的基因序列与标准序列为什么有差别？ |
| 答：一段基因序列经扩增后，克隆到载体中进行测序。在两个层次上可能导致序列发生变化。首先在CR扩增过程中就可能产生错误。将片段克隆到载体中也有可能发生突变。其次，测序的准确率问题。ABI公司承诺其仪器的测序精度在一定范围内可以达到98.5%以上。由于仪器准确率的限制，在一个较长的序列中发生碱基序列错误是难以避免的。在确认克隆无误的情况下，通过双向测序可以最大限度减少测序的错误。您如果想得到您的最准确的序列，进行双向测序是很有必要的。只进行简单的单向测序，我们无法保证所测序列的完全准确性，这是由仪器的精度决定的。 |
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| 11、过短的PCR产物为什么不适于直接测序？ |
| 答：首先过短的PCR产物纯化困难，一般的PCR产物纯化试剂盒都要求PCR产物片段大于150bp，过短的PCR产物纯化和准确定量都非常困难。因此我们要求用于测序的PCR产物一般不低于150bp长度。其次，由于测序技术本身的限制，测序反应对环境的干扰比较敏感，模板太短的PCR测序受外界的干扰更大，很容易造成测序失败。 |
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| 12、用测序的方法检测点突变可靠吗？ |
| 答：有的客户想用测序的方法检测点突变体，我认为该方法可靠性不高。主要有以下两个原因。首先，们并不清楚突变的序列与正常的序列的比例是多少。测序反应的信号强度直接与模板的量有关，如果突变的模板所占的比例很少，将直接作为背景噪音了，很难检测出来。只有当测序反应体系中正常的和突变的模板量比较接近时，才能较可靠地检测到突变体的存在。其次，在同一位置，不同碱基的信号强度一般是不一样的。这样即使突变的模板所占的比较较高时，也不一定能准确检测到突变的存在。另外，测序仪是设计用来测序正常的碱基序列的，软件在对扫描的结果进行处理时，会尽量提高主峰而将背景信号尽量压低，以得到尽可能好的结果。因此，当某处出现双峰时，测序仪一般会认为信号弱的峰为背景信号，在处理过程中，将弱的峰进一步压低，这样根部不立于突变体的检测。因此认为，用测序的方法检测突变体的存在不是一个好的方法。 |
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13、我要求5’到3’正向测序，为什么你们给我的序列是反的？
答：您指的可能是插入片段的方向，而我们并不清楚您的样品是如何构建的。我们只能根据质粒上的序列来确定测序方向，所以在测序引物一栏中请不要使用3’引物和5’引物这样的字样，因为我们手中的资料在注明方向时可能和您手中的资料方向相反，请以T7，T3，SP6，M13f，M13r这样的形式来填写，或注明酶切位点方向比如“测序方向EcoRI到HindIII”。我们手中等质粒资料有限，有时还需要您提供质粒的相关资料。 |
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14、我的样品在你们所说的可靠范围内有一处存在疑问，能否重新测一次？
答：我们希望您能够告诉我们存在疑问的位点的位置，如果从测序报告上的确无法作出准确判读，我们会重新进行实验。如果您指出的位点信号清晰准确，您仍然要求再进行一次实验，那么实验结果和验证实验是相同的。 |
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15、我的样品送测序前已经鉴定过了，有插入片段的，为什么你给我的测序结果是一个空质粒？
答：造成这种现象主要有两个原因。
（1）鉴定过程中的假阳性。鉴定插入片段主要是通过PCR和酶切两种方式鉴定。由于PCR反应受多种条件的影响，在鉴定过程中易产生假阳性，而酶切鉴定是比较可靠的鉴定方式。
（2）我们由于条件的限制，无法单独的对某一个客户的样品进行特定条件的培养，所以可能在培养过程中发生插入片段的丢失。由于这种情况的发生无法事先预期到，所以我们也只能对出现这样情况的客户说抱歉。直接提供质粒虽然可以避免这样的情况，但由于质粒制备上的问题，测序的成功率可能会受到影响。 |
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16、DNA片段很长，一个反应读不到头，怎么办？
答：如果DNA片段在载体上，可以用载体上两端的引物同时测序，让其中间交叉互补，便可完全测通。如果这样还读不通，可在已经测出序列的450～500个碱基处设计测序引物作进一步测序（此称为PrimerWalking法），便可完全测序。 |
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17、我的样品你们已经测通了，但为什么在overlap区有这么多的错配，给出的全序列和单个报告也称作差异，我该相信谁？
答：给出的全序列是一个拼接的结果，当互相拼接的两个序列存在差异时，应该以序列质量更好的应该为主，这也就是为什么会出现错配和全序列与单个测序结果的差异。 |
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18、你们为什么在primer walking时总将引物设计的那么靠前？
答：我们在设计引物时有两个准则。一是设计引物区域的序列必须准确，二是在引物区后必须还有足够的准确序列以便拼接。这样我们设计引物的位置就必然比较靠前，在满足软件设定的条件下，我们总会选取最靠近3’端的引物来作为最终的测序引物。 |
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19、我有一个4KB的PCR片段，希望你们帮我测通。
答：大于2KB的PCR片段要测通最好是构建好克隆后再进行测序。这样模板更加稳定，测序效果也更加好一些。 |
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20、测序完成后，测序样品和引物将如何处理（或保存）？
答：客户需要将测序样品或引物（客户自带的）返还时，我们在发送测序报告的同时，按客户要求寄回样品或引物（客户自带的）。对于没返回的测序样品和引物，公司负责保存1个月（从样品收到之日算起），超过1个月还需测序的样品，请客户另行提供 |
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